Ben Stiller volta nesta seqüencia no papel de Larry Daley, cargo de guarda-noturno no Museu de História Natural, em Nova York. Mas desta vez a ação se dá no museu Smithsonian de Washington, na capital dos Estados Unidos, onde ganham vida personalidades da história americana entre eles presidentes, Amelia Earhart (Amy Adams), uma das pioneiras da aviação, além de um improvável faraó, Kah Mun Rah (Hank Azaria).